Pewarnaan Gram Bakteri

Tujuan : Membedakan bakteri gram positif dan gram negatif

Dasar Teori

Teknik pengecatan Gram dikembangkan oleh Hans Christian Gram (dokter berkebangsaan Denmark, 1884). Pengecatan Gram merupakan salah satu langkah awal mengidentifikasi sel bakteri yang memisahkan bakteri menjadi 2 kelompok yaitu bakteri Gram positif (berwarna ungu/biru) dan bakteri Gram negatif (berwarna merah)

Perbedaan 2 kelompok bakteri ini didasarkan pada kemampuan sel menahan (mengikat) warna ungu dari kristal violet selama proses dekolorisasi oleh alkohol. Bakteri gram positif tidak mengalami dekolorisasi karena tetap mengikat warna ungu kristal violet dan pada tahap akhir pengecatan tidak terwarnai safranin. Bakteri gram negatif mengalami dekolorisasi oleh alkohol dan pada tahap akhir pengecatan terwarnai menjadi merah oleh safranin.

Bakteri gram negatif memiliki 3 lapisan dinding sel. Lapisan terluar yaitu lipoposakarida (lipid) kemungkinan tercuci oleh alkohol, sehingga pada saat diwarnai dengan safranin akan berwarna merah. Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, pori-pori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga dinding sel tetap menahan warna biru.

Sel bakteri gram positif mungkin akan tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.

Alat dan bahan :

- biakan bakteri

- larutan kristal violet

- larutan iodin

- larutan alkohol (etil alkohol 95%)

- kaca objek dan kaca penutup

- mikroskop

- jarum ose

- bunsen (lampu spiritus)

- aquadesh

Langkah Kerja :

1. Kaca objek dibersihkan dengan alkohol dan dilewatkan beberapa kali pada nyala api bunsen

2. Membuat olesan tipis bakteri dengan mengambil isolat bakteri dengan jarum ose secara aseptis dan diberi 1-2 tetes aquadesh. Kering anginkan dan melewatkannya pada nyala api bunsen (lampu sriritus)

3. Olesan tersebut dibubuhi kristal violet (Gram A = cat utama), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering

4. Dibubuhi dengan larutan iodin (Gram B = larutan mordan), dibiarkan selama 30 detik, kemudian dicuci pada air mengalir hingga tetesan menjadi bening, dianginkan hingga kering

5. Melakukan dekolorisasi dengan dibubuhi etil alkohol 95% selama 10-20 detik, segera aliri dengan air selama beberapa detik untuk menghentikan aktivitas dekolorisasi, dianginkan hingga kering

6. Olesan bakteri ditetesi dengan safranin selama 20-30 detik, dicuci dengan air mengalir selama beberapa detik untuk menghabiskan sisa-sisa cat. Selanjutnya air dihisap dengan kertas penghisap dan kering anginkan

7. Melakukan pengamatan dengan mikroskop dan sel-sel yang tampak, digambar pada lembar kegiatan

Preparat basah bakteri dengan pewarnaan GramPerbesaran : … kali
Gambar.	Keterangan 1. 2.

Mari kita diskusikan:

1. Bagaimana hasil pengamatan dari bakteri setelah dilakukan pewarnaan Gram?

2. Mengapa sel bakteri ada yang berwarna biru (ungu) dan merah?

3. Apakah sel yang berwarna merah selalu bakteri gram negatif?

Catatan :

- Kegiatan ini memerlukan bimbingan dari guru, membutuhkan peralatan dan bahan laboratorium khusus seperti jarum ose, kaca objek, bunsen, larutan kristal violet, iodin, alkohol, safranin dan mikroskop

- Teknik aseptis dilakukan untuk menghindari terjadinya kontaminasi mikroba. Teknik aseptis yang dilakukan pada kegiatan ini pada saat awal membersihkan kaca benda dan pada saat membuat olesan pada kaca benda dari biakan bakteri