Informasi genetik pada suatu makhluk hidup tersimpan pada DNA-nya. Nah, untuk mengetahui informasi genetik tersebut digunakan teknik DNA Sequencing, yaitu metode yang digunakan untuk menentukan urutan basa nukleotida (adenine, guanine, cytosine dan thymine) pada molekul DNA. Saat ini teknik DNA Sequencing sudah memasuki tahap baru yang mengarah pada large scale atau high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali run saja.
Meskipun begitu, teknik lama berbasis chain-termination masih umum digunakan, bahkan sangat efisien untuk menentukan sekuen DNA fragmen pendek (masih dalam hitungan kilobasa). Jadi ditemukannya teknik DNA Sequencing yang lebih canggih tidak serta merta bakal menggusur mesin-mesin capillary sequencing yang sudah “merajalela” di berbagai laboratorium biologi molekuler di seluruh dunia.
Artikel ini akan membahas prinsip dasar dan protokol DNA sequencing berbasis metode chain-termination menggunakan mesin automated capillary sequencer.
Prinsip Dasar DNA Sequencing
DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing.
cycle-sequencing
Proses Cycle Sequencing (Image from appliedbiosystems.com)
Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
* Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR
* ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3′-OH pada ribosa.
dntp-ddntp
Struktur molekul dNTP dan ddNTP, perhatikan bedanya (Image from csa.fi.it)
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3′-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5′-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester.
Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Lalu bagaimana caranya menentukan urutan basa DNA dari produk cycle sequencing ini?
Cara Klasik
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.
sanger-sequencing-method
Prinsip Sanger Method dengan primer labelling (Image from noaa.gov)
Dye Primers dengan Label Berbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1 lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi cycle sequencing.
dye-primer-sequencing
Prinsip Sanger Method dengan primer fluorescent labelling yang berbeda-beda (Image from appliedbiosystems.com)
Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara sebelumnya, lebih mudah mana membacanya?
Radioactive Fluorescent Seq
Pembacaan sekuen DNA, lebih mudah mana? (Image from wikipedia.org)
Dye-Terminators Sequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja. Sangat simple dan cepat.
dye-terminator-sequencing
Prinsip Sanger Method dengan dye dideoxy terminator (Image from appliedbiosystems.com)
Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga 96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.
Hasil pembacaan mesin sequencer disebut electropherogram, yaitu peak-peak berwarna yang menunjukkan urutan basa DNA-nya.
electropherogram
Contoh Electropherogram (image from ggpht.com)
Teknik DNA Sequencing yang berbasis fragment analysis saat ini tidak hanya digunakan untuk menentukan urutan basa-basa DNA semata, tapi bisa dikembangkan untuk berbagai aplikasi, seperti penentuan SNP (Single Nucleotide Polymorphism), analisa keragaman genetik seperti DNA Microsatellite dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), community analysis seperti tRFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) dan segudang aplikasi lainnya. Banyaknya aplikasi DNA Sequencing kapiler ini menunjukkan bahwa metode ini –meskipun kini tergolong “lambat” setelah ditemukannya high-throughput sequencing– akan tetap jadi primadona dan andalan para life-scientist di seluruh dunia. Dan tak heran pula jika Frederick Sanger menerima hadiah Nobel bidang kimia untuk kedua kalinya di tahun 1980 atas penemuannya ini.
